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随着国家勉励新药研发、药品审评审批制度革新的快速推进，化药注册分类、上市许可持有人制度等重磅政策的陆续出台，我国新药研发迎来暖春。关于力图在立异药领域深耕的从颐魅者而言，如何洞悉全局，乘势而为，或将成为未来成败的要害。
为此，广州威廉希尔williamhill医药微信民众号特邀生物剖析专家、威廉希尔williamhill医药子公司深圳博瑞副总经理袁智博士，开设“袁来如此”专栏，就大分子生物剖析、药代动力学等相关话题展开专题研究，希望通过相关知识与经验的分享，引发更多读者的讨论交流，加速振兴中国的生物医药工业生长，敬请垂注！
本文为“袁来如此”专栏的第一篇，旨在凭据已宣布的文献资料，对与大分子生物剖析相关的知识进行系统地介绍。
配体结合式测试要领（LBA，也称为immunoassays）是一种常用的剖析工具，用于凭据与其他生物分子的相互结相助用（binding interaction），定量测定生物分子（目标剖析物，Analyte）在生物体液中的浓度。LBA要求至少使用一个生物分子来定量目标剖析物，这个生物分子通常被称为要害试剂，须能够特异性地结合目标剖析物。
LBA可分为两大类：（1）液相结合测试，其目标剖析物与标记过的检测试剂之间的结合反应爆发在溶液相（图1A） ；（2）固相结合测试，其中一个要害试剂被牢固到固体外貌，如微孔板或树脂（图1B），以捕获样本中的目标剖析物。液相测试通常需要疏散办法，如色谱或电泳或离心，从而将目标剖析物-标记检测试剂从未结合的分子中疏散出来进行定量。
在应用上，LBA是重要的评估生物药PK/TK时的主要定量剖析要领之一，该要领的特异性和选择性取决于目标剖析物与其他生物分子（如受体、针对候选生物药的抗体和核酸适配体（aptamer））的相互作用。
该要领中可视察到仪器响应与生物药的浓度间接相关，简言之，检测信号的来源是酶化学反应或放射化学反应，而这些反应则是种种相互结相助用（binding interactions）的一部分。
一般而言，大分子的物理化学特性无法直接爆发检测信号，不可用于这样的定量剖析要领。主要原因在于这些binding interactions的内在性质，LBA的标（校）准曲线的动态（定量）规模比较狭窄，同时也是非线性，S型的（sigmoidal curve）。
如图1所示，在液相测试中，结合反应在溶液中发生，其中一个目标剖析物与标记过的检测试剂结合，然后再通事后续的疏散操作将目标剖析物-标记检测试剂从未结合的分子中疏散出来。
在固相测试中，一个要害试剂被牢固到固体外貌，如微孔板或树脂，此试剂在固体外貌结合目标剖析物，从而致使未结合的分子被疏散出来。
Yalow和 Benson于1960年开发的测定人类胰岛素的要领，是放射免疫测定（RIA）的标记性例子，Yalow因此于1977年获得诺贝尔奖。简单地说，就是通过用鱼精蛋白锌牛胰岛素或商业通例牛胰岛素免疫豚鼠，以获得作为该RIA要领要害试剂的胰岛素结合抗体。
在这种要领中，由于缺乏人类胰岛素的结晶体，因此I131标记的结晶牛胰岛素（胰岛素-I131）被用作示踪剂。此 RIA 的原理是基于样本中的人胰岛素与豚鼠血清中的胰岛素结合抗体的强力结合（图2中的办法1），并让已知浓度的胰岛素-I131与该抗体的结合竞争（图2办法2-3）。胰岛素-I131与胰岛素结合抗体的结合在溶液中进行，游离的胰岛素-I131与结合了抗体的胰岛素-I131的疏散通过纸色谱电泳技术实现，这就使得定量测定胰岛素-I131成为可能，其代表了样本中胰岛素的浓度。在此要领中，最低可定量的胰岛素浓度为1.4μU。
在这个有里程碑意义的研究宣布之后，RIA在20世纪后期获得了广泛的应用。在使用适当的要害试剂时，RIA灵敏度和选择性都极高，而其主要挑战包括使用和处理放射性质料的许可证要求、放射性同位素的标记效率、本钱及其有限的半衰期。在RIA获得应用的十年内，即20世纪的70年代初，就泛起了非同位素免疫测定，如酶免疫测定（enzyme immunoassays，EIA），EIA通常被称为ELISA，即酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay）。
Engvall和Perlmann在1971年首次描述了一个定量兔免疫球卵白G（兔IgG）的ELISA要领。其实质就是从羊血清中提取的抗兔IgG用于结合兔子IgG，进而结合了一种碱性磷酸酶（ALP）的兔IgG被用来与兔IgG相互竞争和抗兔IgG血清的结合，以此建立浓度与仪器响应（信号）之间的关系，生成的仪器信号与样本中的IgG量成反比。随着技术的不绝生长，学界运用了差别的酶，如辣根过氧化物酶（HRP）、β-半乳糖苷酶（GAL）和荧光素酶（luciferase），使得EIA具有与RIA相当的灵敏度。
图 2. Yalow最初发明的胰岛素放射免疫测定的原理图。样本中的胰岛素在溶液中与抗胰岛素血清结合（办法1），然后把已知浓度的I131标记的牛胰岛素添加到反应溶液中（办法2），样本中的胰岛素与I131标记的牛胰岛素（办法3）相互竞争与抗体的结合。使用人胰岛素制备的标准曲线以及胰岛素抗体结合的I131标记牛胰岛素的浓度可以盘算样本中被置换的胰岛素的浓度。
竞争式ELISA花样是基于初始的胰岛素RIA和IgG EIA要领中的结合竞争。来自样品的目标剖析物（analyte）和参照剖析物（reference analyte）与剖析物特异性的抗体结合之间的竞争是这种花样的要害。
抗体或目标剖析物都可以标记酶，并用于结合反应。使用标记抗体（图3Ai）时，参照剖析物首先被动地吸附到微孔板的孔中，然后加入含有目标剖析物的样本，如细胞裂解液、血清等，并与牢固浓度的标记抗体一起孵育。样本中的目标剖析物与牢固的剖析物竞争，以结合有限数量的标记抗体，随后的酶反应爆发的信号与样本中目标剖析物的浓度成反比� ；蛘�，可以使用固相吸附的抗体和标记剖析物（图3Aii），样本中的目标剖析物与牢固数量的标记剖析物配合孵育，并与之相互竞争和牢固抗体的结合。与前面的示例中一样，生成的信号与样本中目标剖析物的浓度成反比。
直接式ELISA是最简单的ELISA花样，样品中的目标剖析物吸附到微孔板的孔中，通过酶偶联试剂或标记检测抗体，直接实现目标剖析物的检测，如图3B所示。
图3. 竞争式（Ai & Aii）、直接（B）和间接（C）ELISA测试花样的原理图。目标剖析物（Analyte）代表被测定的目标卵白质。在竞争式ELISA中，可以标记目标剖析物或抗体，而在直接或间接ELISA花样中，只标记检测抗体。
间接ELISA类似于直接ELISA，两者间主要差别在于主要（primary）抗体未被标记。目标剖析物的检测是通过再次添加一个酶偶联试剂或标记检测抗体，使其与主要抗体结合而实现的，如图3C 所示。
直接ELISA更快速，因为它比间接ELISA少一个办法。它通常用于需要快速完成的通例测试，商业化的家用有身测试就是这种花样的一个例子。而间接ELISA虽然较直接ELISA多一个办法，但信号放大通常优于直接ELISA。因此，间接ELISA通常比直接ELISA更敏感，可以丈量更低品貌的卵白质。
正如图3C 所示，间接ELISA较直接ELISA增加的办法正是来自于样本的目标剖析物直接吸附到微孔板，但想要抵达这样的效果，亦有一定的难度。因为在洗板办法中，可能会洗掉目标剖析物，因此可能会增加测试的变异性。别的，非特异性地结合到微孔板的其它卵白可能导致假阳性结果。为了克服上述挑战，其它可靠性更高的花样进而衍生出来，其中有通常被称为夹心、桥联或竞争性ELISA（在夹心或桥联ELISA花样中），在这些花样中，一种能与目标剖析物特异性结合的生物试剂首先被吸附到微孔板中。
图4. 夹心式ELISA（A）和桥接式（B）ELISA的原理图
夹心式ELISA需要两个差别的试剂或抗体，一个用于捕获，另一个用于检测目标剖析物。这些试剂与目标剖析物的差别表位（epitopes，结合位点）结合，从而形成夹心式花样（图4A），由此爆发的相互作用具有特别高的特异性（因为捕获和检测办法都需要特异的表位识别，才华生成检测信号）。
桥联ELISA常用于测定具有两个相同抗原结合位点(2价)的抗体或其它目标剖析物的浓度，可以标记与捕获相同的试剂，用于检测一个二价的目标剖析物，因此，目标剖析物可被视为捕获和检测试剂之间的桥梁（图 4B）。夹心或桥接ELISA 花样均可设计成为竞争式的ELISA。
上述花样是ELISA的基本设计，所有花样都可以使用竞争或抑制条件加以调解，来测定抗原或抗体（图5），所有要领都要求与试剂预先反应/孵育才华抵达最佳状态。这些最佳状态可以通过添加抗原（图5a）或抗体（图5b）来给予挑战。随着溶液中游离的抗原（抗体）的增加，能够与牢固底物（immobilized substrate）结合的抗体（抗原）的数量则减少。洗涤办法后，添加生色剂底物（chromophore substrate）以爆发信号（颜色变革或发光）�？固�/抗原挑战引起的信号变革揭示了有关竞争性抗原/抗体的信息。竞争式ELISA关于测定庞大混淆物中的抗原浓度相当有用，特别是在可能含有抗原的未知样品与含有已知数量的纯化抗原的类似样品时。
免疫表位（epitope）是宿主免疫系统一般能够识别的抗原分子的一部分。当抗原的表位以非共价键的形式与其所诱导爆发的抗体简直定互补性的区域（complementarity determining region）相互作用时，就会爆发特异性的识别。
抗体亲和力（affinity）体现抗体与其简单目标剖析物（analyte）/抗原（antigen）结合的烈度（intensity）或强度（strength），由解离常数（Kd）代表。低亲和力抗体与抗原结合弱，容易解离 ；而高亲和力抗体与抗原结合很是强，在多次的洗涤办法中不易解离。从ELISA的角度来看，后者是首选，通常用于捕获目标剖析物。
亲和度（Avidity）是权衡一个抗体与多个抗原决定因子（antigenic determinants）结合的整体强度的指标�？固宥阅骋桓鼋岷衔坏愕那缀土Σ⒉蛔苁悄芊从固�-抗原相互作用的强度，例如免疫球卵白G（IgG）有两个抗原结合位点（2价），而IgM有10个抗原结合位点（10价），亲和度体现IgG或IgM的，划分关于2个或10个抗原分子的整体结合强度（overall strength）。
要害试剂
一个ELISA要领最重要的组成部分是测试试剂，它决定了ELISA要领的灵敏度、特异性和要领的质量。ELISAs常用于药物开发：在PK评估中，定量测定卵白生物药的浓度 ；测定内源性卵白和生物标记物 ；检测抗药物抗体的保存以进行免疫原性评估等。LBA要领首选的要害试剂是单克隆抗体（MAbs）或多克隆抗体（PAbs），而不是重组靶标卵白。为了爆发PAbs或MAbs，需要将生物药或生物标记物卵白及其佐剂或载体，凭据相关应用给到合适的宿主动物物种上进行免疫。关于PAbs，兔子、山羊和绵羊是最常用的宿主物种，因为它们的体型大（爆发的抗体量也大），容易找到血管和强健的免疫反应。
用于免疫的每一个抗原都是高度庞大的，因为它可以泛起大量的，可以被差别的淋巴细胞识别的表位,这些淋巴细胞随后被激活。激活了的淋巴细胞增殖，剖析成浆细胞，并排泄出多克隆抗体的混淆体。PAb库（混淆体）代表了差别抗体的荟萃群体，这些抗体可以识别抗原的多个表位(用于ELISA剖析)。为了生产MAbs，需要进一步疏散单个淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞融合，以爆发不死的杂交瘤细胞，从而连续爆发特定的MAb。因此，同一个克�。╟lone）的抗体只识别一个抗原的单个表位。在ELISA中会频繁使用MAbs或PAbs，其选择（关于每种ELISA花样而言）取决于许多考虑因素：如可及性（Availability）、亲和力、特异性（Specificity）和交叉反应性（Cross-reactivity）。
抗体的特异性（specificity）是特异性地结合相关抗原的能力，与ELISA要领的选择性（selectivity）不尽相同，但相关。选择性是一个定量剖析要领，在其它潜在滋扰身分保存的情况下，从众多其它无关的卵白质中鉴别和定量测定目标剖析物浓度的能力。交叉反应性（cross-reactivity）是指抗体与除目标抗原之外的其它多个抗原结合的能力。当抗原（目标剖析物）的与抗体试剂结合的表位与其它卵白质相似时就会爆发交叉反应。一般来说，特异性和交叉反应性对ELISA要领的选择性和基质效应有很大影响。如果使用高亲和力抗体作为捕获试剂，抗体/目标剖析物的复合物就能够在含有多种卵白质的“混淆物”样品中有效地形成，基质效应会随之降低，而要领的选择性最终会获得提升。
表1总结了ELISA可能用到的试剂和种种通用或首选花样。
测试试剂的可及性可能因药物开发的不同阶段而异。在早期探索阶段，可能无法获得MAbs或PAbs，故经常选择重组生产的配体（即生物药的靶点）作为要害试剂来测定游离的卵白生物药(therapeutic protein，TP)的浓度。在早期临床前研究中，针对IgG Fc部分的通用抗体可用于单克隆抗体药物，尽管仅能测定总浓度（结合靶标后的TP +游离的TPf）。
生物标记物的定量剖析要领
种种体外诊断试剂盒在商业上可用于药物的早期发明阶段，也可从差别的供应商获得种种重组卵白和抗生物标记物卵白的抗体。虽然生物标记物的定量剖析要领与PK要领相似，但这二者之间保存明显差别。与PK要领类似，生物标记物的定量剖析要领可用于测定目标基质中生物标记物卵白的游离浓度或总浓度。夹心式测试花样是主要选择，通常用于测定生物标记物卵白的游离或总浓度。虽然当一个生物药具有抑制作用时，需要丈量游离的生物标志物卵白浓度，但开发测定游离的生物标记物卵白的要领有相当的挑战性，可能需要特另外疏散办法。
人源化的或全人源的单克隆抗体或重组卵白，作为药物给予受试者/动物后，可诱导形成针对该生物药的抗体，特别是在临床前的动物试验中，这些由生物药诱导而形成的抗体通常被称为抗药物抗体（ADA）。免疫检测要领是检测ADA是否保存于血清中的第一级检测。差别的ADA反应，如表位特异性（idiotype vs. nonidiotype，特异与非特异性）和数量（滴度或相对浓度），会影响对ADA和生物药的准确定量。由于ADAs会在血液循环中与生物药形成免疫复合物，高浓度的卵白生物药能够滋扰ADA的检测。
备注：idiotype：免疫球卵白（如IgG）可变区域的分子结构和构象，付与其抗原特异性。
LBA测试要领在种种生物分子的定量剖析方面拥有种种优势。它们在大大都平台（如比色计或平面电化学发光）上，本钱通常很低。当高亲和力MAbs用于LBAs时，LBA要领在检测和定量剖析保存于异质性的基质情况中的目标剖析物方面，具有高度灵敏度和特异性。出于研究目的，该类要领的灵敏度可以低至每毫升毫微微克的级别（femtogram/mL）。大大都LBAs的操作程序不涉及样品疏散的办法，而基于LC-MS/MS的定量剖析方规则需要。虽然，LBA也有几个缺点，与LC-MS/MS要领相比，LBA要领的动态规模较狭窄。虽然用于基础研究的要领可以抵达4-6个指数级的动态规模，但用于规范性研究（regulated study）的验证过的要领，其定量规模往往仅为2-3个指数级，这是因为必须坚持要领的稳健性和更好的重现性。
最重要的区别是，LBA的性能取决于所使用试剂的质量和特异性。因此，试剂生成/选择（MAbs或PAbs）是要领开发历程中的要害办法，这可能很是耗时，3到9个月不等。当使用剖析物特异性的试剂来捕获目标剖析物时，这个缺点对LC-MS/MS要领也是保存的。从生物标记物要领的角度来看，试剂的交叉反应可导致该要领的非特异性。因此，强烈建议进行特另外测试以剖析试剂的交叉反应性和非特异性。
本文概述了LBA测试要领，包括其主要看法的起源和演变，并且回首了常用的大分子生物剖析要领的测试花样。最初的LBA测试要领降生于1960年，是为测定胰岛素而开发的放射免疫测试（radioimmunoassay），LBA测试要领的基础是至少有一种卵白质与感兴趣的目标剖析物有相互作用。在当今的实验室, 酶免疫测试（enzyme immunoassay）已在很洪流平上取代了放射性免疫测试，成为了LBA测试要领的首选形式。
别的，本文还介绍了其它种种测试花样，如竞争式（competitive）、夹心式（sandwich）和桥接式（bridging），以及其所需的要害试剂。最后，简明简明地讨论了LBA测试要领在卵白质生物药开发中的应用，以及与其它生物剖析平台的比较。
自上世纪60年代对胰岛素进行定量测定以来，基于与其它生物分子结相助用的LBA要领已被广泛地用于生物分子的定量剖析。例如，在卵白质生物药开发历程中，这些要领为定量剖析或检测卵白质提供了一种准确和经济有效的要领。测试试剂（MAbs或PAbs）生成/选择是LBA要领开发历程中的要害办法，一旦选择好了试剂，差别测试平台上的LBA要领能够提供显著节约时间和经济本钱。
如前所述，另一个主要的大分子生物剖析平台是液相色谱-质谱（LC-MS/MS）。在小分子药物的生物剖析中，LC-MS/MS要领是毋庸置疑的王者，在大分子剖析中，LC-MS/MS的重要性也在不绝地增加，特别是在与LBA要领以某种形式组合之后�？梢钥隙�，生物剖析业界将继续探索LC-MS/MS在卵白质药物的生物剖析中的应用。生物剖析行业必须证明LC-MS/MS在药物开发的整个历程中，与LBA要领相比较，具有重现性（reproducibility）、可转移性（transferability）、可靠性（reliability）和本钱效益（cost–effectiveness）等方面的显著优势。本系列后续将介绍相关知识，敬请关注。
本文来源：生物制药小编
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