本期《袁来如此》为系列文章《大分子生物剖析概论》的第十三篇 ，旨在凭据已宣布的文献资料 ，对评估药物临床前PK/PD时 ，开发和选择LBA要领的战略作开端介绍 。
由于内容篇幅较长 ，本文将接纳上下篇形式进行推送 ，敬请垂注！《袁来如此》专栏系广州威廉希尔williamhill医药微信民众号打造的科普学术专栏 ，内容均为威廉希尔williamhill医药子公司深圳博瑞副总经理袁智博士原创 。
1.导论
药物发明是一个快速的transformative的历程 ，其包括靶标识别、靶标验证、先导药物的识别和优化 。随着项目推进经过这些阶段 ，对生物剖析的需求也在相应地改变 � ？⒑鲜实纳锲饰鲆炜梢蕴峁┮┐ρШ鸵┬ФρВ≒K/PD）的名贵数据 ，以支持在新药研发项目差别阶段中要害的药效和宁静性研究 ，从而为项目的进展涤讪坚实的基础 。在新药早期的发明阶段 ，会同时考虑差别药物模式（drug modalities）的多个分子 。一般有多种模式可供选择 ，取决于靶标及其位置 ，例如 ，古板的小分子、多肽、单克隆抗体、抗体-药物偶联物、纳米抗体、融合卵白药物、双特异性生物药和寡核苷酸 。在生物技术工业中 ，药物的快速发明以及快速开发正推动着生物剖析领域的生长和演进 。这种演进的主要内容是 ，缩短剖析运行时间 ，实施multiplex剖析 ，提高灵敏度 ，降低样品体积的消耗 ，实现剖析测试的自动化 。
本文关注的重点是临床前卵白药物生物剖析要领的开发战略 ，即LBA剖析平台的选择和要领开发中的要害注意事项 。本系列之前的文章 ，基本是关注用于临床样天职析的LBA要领 。为了简单起见 ，在此文中仅评估用于检测卵白药物的sandwich format的LBA ，而卵白药物在大大都情况下 ，意味着单克隆抗体 。虽然相关技术有多方面的进步 ，本文将重点关注已经商业化和在生物剖析行业十分流行的技术 。文末的参考可以引导读者很是详细地了解相关内容 。
目前最流行的3种技术是ELISA、电化学发光（ECL、MSD、NJ、USA）和Gyrolab®（Gyros Protein Technologies、Uppsala、Sweden） 。 同时 ，本文会简要地涵盖以下几项不经常使用但具有超高灵敏度的技术：如基于Single Molecule Array平台（单分子阵列 ，Simoa™） ，单分子计数[SMC™]的Erenna® 平台（Singulex Inc、CA、USA） ，免疫聚合酶链反应平台（immuno-polymerase chain reaction、immuno-PCR、 Imperacer®、Chimera Biotec GmbH、Dortmund、Germany） 。另外 ，还会简要介绍multiplexing的Luminex平台（Luminex xMAPR、Luminex Corporation、TX、USA） 。在药物发明阶段 ，剖析要领开发是生物剖析的主要内容之一 ，同时 ，应当特别考虑评估耐受性（tolerance）和分子完整性（molecular integrity） 。
2.临床前LBA要领的要害参数
用于药物发明阶段的生物剖析要领有5个重要参数：样品体积要求 ，定量的动态规模 ，测试运行时间 ，灵敏度和自动化水平 。本文将简要地评估这些参数 ，并介绍这些参数在选择检测平台时发挥的重要作用 。
1) 样本体积消耗
从小鼠身上单次收罗的血清或血浆样本的体积约为50ml 。随着在动物研究中实验实施3R（替换replacement ，减少reduction 和细化refinement ） ，生物剖析业界正在探索多种微体积采样要领 ，而这将进一步大幅度地减少样本体积 。另外 ，在剖析小鼠脑脊液等基质的样本时 ，只有2-5ml的体积可用 � ？悸堑接锌赡芤馔馑鹗а� ，故从动物获得的样本体积应足以剖析样本至少两次 。因此 ，应当首选能够使用低样本体积的剖析技术宁静台 。
2) 定量动态规模
能够在宽广的动态规模内 ，至少包括3-4个数量级 ，进行定量剖析是极其有益的 。关于PK剖析 ，这允许较高的最小稀释要求（minimum required dilution ，MRD） ，以尽量减少样本基质效应 ，同时为低剂量给药的样本提供所需的定量灵敏度 。同样 ，关于PD ，它允许在更宽广的规模内测试平行性（parallelism） ，从而允许对含有高浓度生物标记物的样品进行大幅度的稀释 。关于生物标记物丈量 ，稀释另有助于最大限度地减少样本和基于缓冲液的标准曲线（替代基质）之间的基质差别 ，从而更精确地生成定量数据 。
3) 剖析运行时间
剖析运行时间是实施PK/PD样天职析所需时间 ，假定使用之前已为该应用开发剖析要领 ，这也意味着假定试剂已标记 ，缓冲液已制备 ，并且相关仪器也已准备就绪 。在non-GLP临床前生物剖析实验室中 ，时间是至关重要的；在大大都情况下 ，最终目标是提供可靠 ，且可以重现的数据 ，同时坚持较短的剖析运行时间 。这就提高了实验室的效率 ，并允许该部分同时支持多个项目 。剖析96样本微孔板的运行时间可以在1-5小时的规模之间 ，具体取决于接纳的剖析技术（关于某些剖析技术 ，有特另外隔夜捕获办法overnight capture step） 。
4) 灵敏度
大大都古板的单克隆抗体的PK定量LLOQ在几个ng/ml规模 。一些高效力药物分子（需要低剂量）和低品貌（或下调了的）的生物标记物可能需要更高的灵敏度 。应当依据个案的情况为这些应用选择相应的剖析平台 。别的 ，高灵敏度的剖析要领是高度依赖所使用的试剂 ，因此获得高特异性和高亲和力的试剂可以大大提高定量的灵敏度 。提升剖析灵敏度也同时降低了对样本体积的要求 ，见1） 。
5) 自动化
自动化平台可缩短剖析人员操作的时间 ，提高生物剖析部分的效率 。在临床前药物开发的情况中 ，剖析平台的完全自动化 ，在需要开发剖析要领且进行通例样天职析的情况下是很是有益的 。同时 ，关于要领开发 ，优化和因基质或物种变革而进行的要领认证 ，需要能够修改自动化平台上的检测要领的灵活性 。
除了剖析测试自动化之外 ，还可以自动化地制备标准品（standards）和质量控制样品（QCs） ，从而节省时间 ，降低珍贵参照（比）物料（reference material）的使用和本钱 ，并减少手动移液爆发的误差 。一些剖析测试平台 ，如Gyrolab ，允许检测的全自动化 ，而Hamilton和HPD300这样的平台 ，则可以允许自动化移液体 ，或制备标准品和QCs 。超高灵敏度的Simoa™平台也支持自动化地样本检测 。
3.临床前LBA免疫测试平台
目前 ，有多种LBA测试平台在新药开发中获得应用 。表1列出了若干LBA测试平台及其比较 。本文将进一步介绍其中几种在生物剖析行业中应用比较广泛的平台 。由于为临床前研究开发剖析要领所选择的LBA平台 ，很可能会继续在临床研究中继续使用 ，因此 ，选择合适的测试平台 ，将会是影响深远的一个重大决定 。
表1. 若干LBA测试平台相关特征的比较
备注：上表中的要领未全部在文中详细介绍 。
近年来 ，一系列immunoassay的新技术 ，特别是基于微（磁）珠（beads ，magnetic ，etc.）的技术 ，从测试花样的物理学/物理化学条理 ，待测物的捕获 ，检测信号的收集/放大 ，数据处理等方面 ，实现了显著改善 ，并取得了相当的商业性乐成 ，虽然这些新要领在化学和生物学条理 ，仍然是基于抗体-抗原的结相助用以及基本的夹心式immunoassay 。本文选择若干获得广泛商业应用的测试平台 ，及其在临床前生物剖析要领开发的应用作开端介绍 ，希望起到抛砖引玉的目的 ，引发更多关于新的剖析测试技术的开发和应用的相关讨论、交流和研究 。
ELISA平台
ELISA是生物制药行业内外使用最广泛的配体结合式（LBA）检测平台 。ELISA的测试花样包括直接式、间接式和夹心式；ELISA经常用作与开发中的新剖析平台进行比较的基� �；在96孔板上 ，通常对样本进行复孔（duplicate）测定 ，手动或半自动运行 。通常使用比色法的检测试剂 ，但有时也使用其他检测试剂 ，如发光（luminescence）和荧光（fluorescence） 。通常 ，对ELISA要领 ，需要监测试剂 ，如抗体（antibodies）、配体（ligands）、缓冲液（buffers）以及批次的变革 。
几十年来 ，古板的ELISA一直是卵白质定量剖析最常用的技术 ，因此也是最可靠的技术之一 。纵然在今天 ，大大都生物标记物的商业检测试剂盒都是基于ELISA的 。大都新剖析技术都与作为金标准的ELISA比较 。可是 ，这种剖析技术也有缺点 ，例如 ，测试运行时间约长为 4-5 小时 ，样品体积消耗大（测定体积为100 ml） ，灵敏度低与LLOQ在大大都情况下接近低-中ng/ml ，以及狭窄定量动态规模（2-3 数量级） 。这项技术关于某些临床前生物剖析的应用仍然很有吸引力 ，好比血清单克隆抗体的PK 。该平台还提供了在要领开发早期阶段评估测试要领差别部分的灵活性 。表2列出了差别检测平台的性能 ，以一个mAb药物为例 。
表2. 与ELISA比色法检测相比较 ，一个mAb在若干检测平台上LBA要领参数的比较
备注：上表中的要领未全部在文中详细介绍 。
电化学发光(Electrochemiluminescence ，MSD)平台
MSD平台是一种基于微孔板的测试花样 ，它利用电化学发光（ECL）信号进行检测 。在这个平台上 ，免疫测试花样类似于用于药物定量和target sample measurements的典范ELISA花样 ，但预计灵敏度会因使用化学发光而增加 。MSD平台似乎主要在检测信号的爆发和收集上 ，相关于ELISA有显著改善：MSD接纳SULFO-TAG（三联吡啶钌）是一种发光底物 ，其分子量约为1000Da（约莫是HRP的1/40） ，因此空间位阻小 ，易于标记抗体 ，且不易故障其与待测物或其它抗体的结合 。SULFO-TAG在阳极外貌失去电子 ，爆发氧化 ，在三丙胺阳离子自由基的催化及三角形脉冲电压引发下 ，可爆发高效、稳定、连续的电化学发光信号 ，使得检测信号增强并稳定（见图1） 。
图1. MSD的电化学发光爆发的检测信号
MSD的电化学发光技术在生物剖析行业广受接待 。它坚持了ELISA花样的优点 ，如要领开发的灵活性 ，另外在其它领域也很是精彩 ，如较小的样品体积要求（测定体积为25–30 ml） ，更高的灵敏度（低-中pg/ml）和宽泛的动态规模（4-5个数量级） 。当以均相的测试花样运行时 ，此平台可能受到钩效应（hook effect）的影响 。钩效应起源于不对适的抗体-抗原浓度比例 ，可是可以减轻甚至消除的 。别的 ，试剂和微孔板容易有批次间的变革 ，因此 ，强烈建议在批次之间进行交叉比较 。
MSD微孔板的孔底为石墨底 ，捕获抗体包被载量可提升10-50倍 ，检测规模比ELISA扩展了10-100倍 ，定量动态规模高达5-6个数量级 ，灵敏度可提升10-1000倍（fg/ml-pg/ml级别） 。凭据对血清免疫学中的“带现象”的理解 ，可推测：包被抗体载量可以凭据检测灵敏度的需要进行调解 ，以制止钩效应（hook effect） 。剖析运行时间接近约3-4小时 ，但考虑到该平台提供的其它优势 ，测试时间可被视为一个合理的折中 。该平台允许同时运行多个96孔板 ，因此在剖析数百个样品时 ，测试一个或多个96孔板也只需要基内幕同的时间 ，这一点可能很是有利 。此平台不是自动化的 ，因为它需要剖析人员加入每个办法 。别的 ，该平台还提供与实验室信息治理系统（LIMS）的集成和US FDA 21 CFR part 11的合规性 ，允许剖析要领结果容易地转移到GLP的情况中 。
Gyrolab平台
Gyrolab是一个非96微孔板的免疫测试平台 ，具有液体处理功效（liquid handling capability） ，使用小体积的样本和试剂在光盘（CD）上实施免疫测定 。该测试花样使用biotinylated捕获试剂和标记有fluorophore的检测试剂 ，在纳升体积的使用亲和力微珠填料的捕获柱（nanoliter volume affinity capture column）上进行测试 。利用CD的微观结构确定样品和试剂的体积 ，并通过旋转CD将样本加到捕获柱上 。在每个CD上 ，有96（在1000nlCD上）-112（在20或200nl CD上）个微观结构 ，可爆发96-112个数据点（1小时/CD运行时间） 。在Gyrolab事情站上 ，样品处理完全自动化 ，液体处理臂将样品和试剂从微孔板转移到CD ，并通过激光/检测器测定每个捕获柱的荧光信号 �；〉腉yrolab xPlore™ 允许无人值守地一次剖析1张CD ，而Gyrolab xPand™允许剖析多达5张CD（即480-560个数据点） 。在大大都情况下 ，动态规模为3-4个数量级 。该平台的灵敏度可与MSD的ECL平台（低-中pg/ml）相媲美 。
Gyrolab是一个自动化的微流体系统（microfluidic system） ，且其离心操作能够高效地处理微量体积 ，因此大大都重复(duplicate）剖析只需要小于5ml的样本体积 ，就可以从同一微孔板重新剖析未使用的样品 。该平台使用包被了捕获抗体的微珠来捕获待测物 ，与下面讨论的Luminex和Simoa平台在捕获待测物的原理上 ，即在更大的固相外貌积上有更多的捕获抗体（与ELISA相比） ，似乎有异曲同工之妙 ，总体效果是提升了捕获待测物的效率 ，提升了灵敏度 。Gyrolab的一个精彩特点是 ，可以选择差别的CD来调解定量的动态规模 ，以满足对低或高浓度样本的剖析 。该剖析技术平台关于大分子的通例临床前PK/PD剖析无疑是很是有效的 。此平台在缩短检测时间方面很是有效 ，无需人工移液和加入剖析的每一办法 。这使得该平台对开发要领和剖析样本都极具吸引力 。别的 ，该平台还提供实验室信息治理系统集成和FDA 21 CFR part 11合规性 ，能够将剖析要领轻松地转移到GLP情况中去 。
Gyros的一个可能缺点是 ，如果以基于微孔板花样开发了剖析要领检测 ，则相同的试剂在转移到Gyros时可能会性能欠佳 ，并且可能需要显著地优化才华获得最佳性能 。这是因为Gyros的孵育时间极短 ，需要高结合效率的捕获试剂 ，而基于微孔板的检测则不需要这种试剂 ，因为较长的孵育时间抵消了该需求 。因此 ，如果使用Gyros ，则需要在同一平台对试剂进行筛选 ，然后测试其剖析性能 ，并开发完整的剖析要领 。
BIAcore平台
基于BIAcore平台的药物剖析 ，依赖于待测物与牢固在传感器芯片（sensor chip surface）外貌的待测物特异的试剂的相互作用 。BIAcore实时监测该结合相互作用 ，并读出以相对响应单位（relative response units ，RU）为单位的响应 ，该响应与Surface Plasmon Resonance（SPR）角度的变革相关 ，并且由传感器芯片外貌的液体薄膜的折射率变革所决定 。折射率的变革与芯片外貌结合的质量成正比 。这种实时的无标记技术与典范的免疫测定法有很大的差别 ，免疫测定法需要多个孵育和洗涤办法 ，以及用于信号读出的标记检测抗体（labeled detection antibody） 。关于临床前药物剖析 ，可以将抗药物特异性抗体牢固在芯片外貌实施通用化检测 ，当样本流经剖析隔室（cell）时 ，该抗体将结合样本中所含有的mAb药物 。其它方法 ，如在芯片上牢固待测物 ，也可用于特定的定量剖析 。关于此平台 ，在验证期间必须经过10个周期的残留（carry-over）测试 ，并且还应确定最大信号值（相关于配景值）的信号噪声比（signal-to-noise ratio） ，以评估样天职析期间的要领运行性能 。别的 ，还必须评估在执行大批量样天职析的较长时期内的芯片稳定性（剖析要领是特定于所使用的芯片类型） 。由于该平台通常运行一夜或更长时间 ，故样本和试剂的稳定性必须比典范的免疫测试要领具有更长的短期稳定性（凌驾24小时） ，并且在Biacore T200上 ，样本的总通量（overall sample throughput）较低 。别的 ，单个剖析运行需要包括校准曲线后和运行序列中间隔的QC样本 。通常 ，这对应于一个微孔板的校准品（calibration standards ，Cs）和样本 。
可以对BIAcore实施IQ/OQ/PQ验证 ，以满足切合21 CFR Part 11的要求 。使BIAcore仪器抵达GLP合规的状态不是一个简单的历程 ，需要投入大宗时间来处理数据传输（data transfer）和合适的校准（随时间推移的）等问题 。
该测试平台更多地用于LBA要害试剂的筛选和表征 。LBA要害试剂一般界说为：看待测物（analyte）特异性的LBA剖析试剂 ，如抗体、多肽、卵白质、耦合物（标记） ，作为试剂的药物和ADA试剂（阳性和阴性比照品） 。
多通道（multiplexing）剖析技术
Multiplexing测试要领可以节省时间和名贵的样品 。可是 ，保存一个局限：即它们经过严格优化 ，只能在指定规模和基质中使用 。差别的待测物对差别的基质和稀释的反应差别 ，因此 ，关于某个待测物 ，优化参数的偏差可能需要重新优化整个multiplexing检测要领 。在临床前生物剖析中 ，需要探索了解多种药物、多个药物变异体、多种药物的组合和多种生物标记物 。因此 ，检测的灵活性是很是要害的 ，对此multiplexing可能资助意义不是很大 。
在样本体积十分有限的特殊情况下 ，可以探索multiplexing 。允许自主开发multiplexing要领的平台包括：Luminex的xMAP技术 ，使用奇特的dyed beads ，并取决于所使用的仪器（MAGPIX、LUMINEX 200或FLEXMAP 3D） ，可以剖析50-500待测物；Quanterix SR-X ，使用6个奇特的磁珠 ，可以multiplexing多达6个待测物；Quanterix SP-X可以multiplexing到10个待测物 ，使用其基于平面阵列的空间疏散的化学发光成像技术 。其中 ，MSD允许从黄金标准的singleplex平台直接转换到U-PLEX平台进行检测；Quanterix的SR-X和SP-X平台在multiplexing时能够提供超高灵敏度 。
Luminex平台
常用的Luminex®100/200™系统是基于流式细胞学（flow cytometry）原理的灵活水平很高的剖析仪 。该系统使用很小的样本体积 ，在单个微孔板的孔/井中multiplex（同时测定）多达100个待测物 。该平台可以操作许多检测花样 ，包括核酸测试要领（nucleic acid assays）、受体-配体测试要领（receptor-ligand assays）、免疫测试要领（immunoassays）和酶测试要领（enzymatic assays） ，并提供快速且经济高效的生物测试结果 。
该系统是xMAP® 3个焦点检测技术的组合 。第1个是xMAP微球 ，这是一个荧光染色 ，微米巨细的聚苯乙烯微球系列 ，既作为标识符 ，又充当建立测试要领的固体外貌 。第2个是基于流式细胞学的仪器（flow cytometry-based instrument） ，Luminex 100/200剖析仪集成了要害的xMAP检测组件 ，如激光、光学器件、流体技术和高速数字信号处理器 。第3个组件是xPONENT®软件 ，它专门设计为基于计划（protocol-based）的数据收罗方法 ，具有强大的数据回归剖析的能力 。
Luminex利用特定染料的珠子（beads） ，该珠子包被有特定的抗待测物抗体 。添加待测物孵育后 ，再添加荧光标记的抗体 ，以检测和定量待测物 。此项技术使用供应商预先生产的试剂盒 ，主要用于PD检测 ，即生物标记物的定量剖析 ，并且接纳多通路检测（multiplexing）的方法 。商业化的试剂盒数量巨大 ，据称达1,300余种 。一个样本可以用于测定多个待测物 ，据称最多可达500个 ，并且可以对每种待测物设置接受标准 。缺乏之处是：差别待测物珠子（analyte beads）有交互滋扰（cross-talk）的倾向 ，并且测试要领对光敏感 ，因此必须接纳特殊的预防步伐 。
超高灵敏的定量剖析技术
关于某些药物和样本基质 ，可能需要具有fg/ml-低pg/ml的超高灵敏度的定量剖析要领 。相关状况包括定量低品貌的生物标记物 ，对强效药物分子的PK剖析和定量极易受到基质效应影响的待测物 ，显然 ，大幅度稀释样本会提升对测定平台灵敏度和定量动态规模的要求 。
目前 ，允许自主开发要领的超高灵敏度的定量剖析平台包括来自Quanterix ，基于Simoa™的数字化ELISA ，来自Singulex的使用单分子计数（single molecule counting）的Erenna™ ，以及来自Chimera Biotec GmbH的基于免疫PCR（immuno-PCR）的Imperacer 。
之前已经宣布的文章详细评估了这3种超高灵敏度的剖析技术 ，以及其它不太流行的剖析技术 。这3种技术都是需要供应商提供检测要领的剖析仪器 ，但都允许用户自主开发检测要领 。当拥有实时定量PCR（qPCR）仪器（thermal cycler fitted with a fluorimeter）时 ，还可以独立于供应商提供的试剂或仪器开发Immuno-PCR要领 。在使用这些技术时 ，需要特别注意一些非通例情况 ，包括Simoa™ 的磁珠偶合 ，DNA与检测试剂的偶合 ，以及无污染地操作immuno-PCR 。
基于单分子阵列（Simoa™）的数字化ELISA
来自Quanterix公司的Simoa™数字化ELISA是一个很有前途的平台 ，它可以使卵白质定量抵达fg/ml 。该技术接纳基于微观顺磁珠（microscopic paramagnetic bead）的免疫测试要领 ，并结合奇特的信号检测和数据收罗系统 。数字化ELISA分2个阶段实施 。在捕获抗原的第1阶段 ，涂有捕获试剂的微观磁珠与样品混淆 ，然后加入生物素标记的检测抗体（biotinlabeled detection antibody）和链球菌素-β-半乳糖酶（streptavidin–b-galactosidase） 。然后 ，这些珠子被加载到光盘上 ，光盘上装有一系列体积为飞升（femtoliter）巨细的微井阵列 。每个微井的直径为4.5mm ，能够容纳直径为2.7mm的珠子数目只能为1或者为0 。被硅胶垫片密封的微井含有荧光底物 ，其用于信号生成和放大（图2） 。Simoa™ 技术在定量剖析的第二阶段接纳了奇特的信号检测系统 。微井（50飞升）中浓度相对较高的发出荧光的产品（阳性事件）和白光散射（white light scattering）测定的总珠子负载可以由标准的CCD摄像机轻松地检测到和纪录 。通过革新几个检测办法 ，Simoa™ 实现了超高灵敏度 。
图2. 在飞升体积（femtoliter）的井阵列中装载 ，密封和成像单个顺磁珠
因为在100mL的反应体积中有约200,000个磁珠 ，而每个磁珠捕获约80,000个抗体分子 ，抗体-待测卵白的比值宁静衡允许高效地在给定的示例中 ，>70%捕获待测物 。由于溶液中有这么多的磁珠 ，并且可以在溶液中运动 ，所以捕获效率进一步提高 ，因为每个目标卵白在不到1分钟时间内就会遇到磁珠 。这与古板的LBA要领中 ，牢固在一个外貌的捕获抗体与待测物的缓慢结合完全相反 。另外 ，优化了的biotin-labeled detection antibody与streptavidin–b-galactosidase之间的比值 ，可减少检测配景并最大化特定信号的收罗 。与Simoa™检测系统相结合 ，相关荧光信号可以通过荧光底物（fluorogenic substrate）的酶消化（enzymatic digestion） ，而进一步放大 。
Simoa™ 检测系统能够检测到单个结合事件（a single binding event） ，该事件可以在低浓度下以数字方法获得（灵敏度增高 ，数字化ELISA） ，或在高浓度模式下以模拟的方法获得（扩展了的定量动态规模） 。荧光用于检测酶活性 ，并能够测定每个磁珠上酶的平均值 。与下面描述的Erenna®平台一样 ，结合数字式和模拟式的读数功效 ，可以实现非� ？砉愕亩慷婺� 。由于最终信号收罗是在平面阵列上完成标准成像 ，因此与使用 Erenna®等流体系统的数值读出相比 ，数据收罗更快 。
尽管Erenna® 和Simoa™ 平台具有数字读出和宽广的定量动态规模等配合点 ，但Simoa™ 平台是一个完全自动化的系统 ，该仪器可以实施样品稀释（高达1:10稀释） ，混淆 ，洗涤 ，孵化和数据收罗办法 。Simoa™ 能够同时测定多达10种差别的待测物（multiplexing） 。这是通过对单个捕获抗体使用差别的dye linkers来实现的 。之后 ，对阵列进行多个波长的荧光成像 ，以识别拥有差别dye linkers的亚组 ，并确定是否保存enzyme reporter标记 。与Singulex和Quanterix一样 ，有许多试剂盒可供选择 。也可以“定制”开发 ，或“自主开发”剖析要领 。
凭借较高的灵敏度、multiplexing和自动化功效 ，该平台看起来很是理想 。Simoa™平台与LIMS系统兼容 ，其软件满足监管级别的生物剖析据FDA 21 CFR part 11的合规性要求 。笔者认为该平台因其超高灵敏度（可以使用微量样本体积）和自动化操作 ，在相当的水平上可以替代Gyrolab平台 ，用于临床前PK样天职析 。
Singulex Erenna®平台
Erenna®免疫测试系统利用两步的历程实现超高灵敏度定量剖析（ultrasensitive assays） 。最初 ，使用biotinylated capture试剂和荧光标记检测试剂 ，在96孔板中实施基于珠子（beads）的夹心式测试花样 。从珠子上洗脱的被捕获待测物被转移到一个384孔的读取板（reading plate） ，然后将该读取板安排到检测仪器上 。然后样本一个接一个地通过毛细管进入flow cell ，并在其中实施激光诱导的单分子检测剖析 。该平台的优势是宽广的定量动态规模 ，其通过奇特的软件曲线拟合算法实现 。该算法利用了多次读数 ，提升了灵敏度 。
与其它测试平台相比 ，检测时间较长 ，但一些线下的自动化设备可用于洗涤和转移办法 。该平台通常用于PD检测 ，但也可用于PK定量剖析 。对供应商生产和供应的试剂盒 ，其稳定性必须由最终用户评估 ，因为试剂的稳定性通常是未知的 。别的 ，可以购置通用试剂 ，以开发内部的检测试剂 ，并且 ，基于微孔板的花样也能兼容使用96或384孔板的平台 。供应商建议对校准品（Cs）进行3次复测（triplicate） ，以便在低浓度下进行精确剖析 � ？梢酝ü齀Q/OQ程序 ，与内部PQ相结合 ，验证Erenna®平台 。如果将Erenna®与LIMS结合 ，以实施监管级生物剖析 ，则一个选择是使用读出的三个信号之一进行浓度剖析 。可是 ，动态规模和灵敏度可能会受到影响 ，具体取决于选择哪个读出的信号 。
Immuno-PCR (Polymerase Chain Reaction)
Immuno-PCR（Chimera）是一种扩增免疫测试技术（signal amplification immunoassay） 。它涉及DNA标记的检测抗体的扩增 ，从而提高灵敏度 。与ELISA中使用的抗体-酶偶合物（antibody–enzyme conjugates）差别 ，IPCR中的要害试剂是抗体-DNA偶合物（antibody–DNA conjugates） ，其中一个DNA标记（marker）与检测抗体相偶合 。然后 ，将DNA polymerase加入到反应主混淆物之中 ，就可以放大检测信号 ，并通过定量PCR（qPCR）而定量测定DNA-marker的浓度 ，从而定量剖析analyte–antibody immunocomplex 。因此 ，该技术主要革新了检测信号的放概略领 。可是 ，如果检测抗体与血清或血浆中的身分爆发交叉反应 ，该平台可能容易受到强大基质效应的影响 。因此 ，在要领验证期间必须评估信噪比 ，并用于确定样天职析期间要领的性能 。
该平台的优点包括宽广的定量动态规模和提升了的灵敏度 ，这对PD剖析是很有益的 。与 Erenna®平台一样 ，检测试剂高度依赖于供应商 ，关于大批量样天职析来说 ，本钱可能很高 。如同MSD、Erenna®和其它基于珠子的平台一样 ，应特别注意标记试剂和微孔板批次的变革 。由于该平台依赖于PCR技术 ，因此在处理样本、试剂和移液器枪头时必须小心谨慎 ，以制止污染 。别的 ，数据剖析可能也会较为麻烦（cumbersome） 。
7. 特别声明
本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方 ，请读者评论和指正 。所有引用的原始信息和资料均来自已经宣布学术期刊, 官方网络报道等果真渠道, 不涉及任何保密信息 。 参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备 �＝哟琳咛峁┯屑壑档奈南准捌淦拦� 。
参 考 文 献
1. Eangoor, P. (2020). "A guided approach to preclinical bioanalysis of proteins using immunoassays for pharmacokinetic and pharmacodynamic assessments." Bioanalysis 12(16): 1105-1110.
2. Fischer SK, et al. Emerging technologies to increase ligand binding assay sensitivity. AAPS J. 17(1), 93–101 (2015).
3. Dudal S, et al. Assay formats: recommendation for best practices and harmonization from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. AAPS J. 16, 194–205 (2014).
4. Patel SR, et al. Microsampling for quantitative bioanalysis, an industry update: output from an AAPS/EBF survey. Bioanalysis 11(7), 619–628 (2019).
5. Roman J, et al. Application of miniaturized immunoassays to discovery pharmacokinetic bioanalysis. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 63(3), 227–235 (2011).
6. Leary BA, et al. Bioanalytical platform comparison using a generic human IgG PK assay format. J. Immunol. Methods 397(1–2), 28–36 (2013).
7. Duo J, et al. Surface plasmon resonance as a tool for ligand-binding assay reagent characterization in bioanalysis of biotherapeutics. Bioanalysis 10(8), 559–576 (2018).
8. Spengler M, et al. Highly sensitive ligand-binding assays in pre-clinical and clinical applications: immuno-PCR and other emerging techniques. Analyst 140(18), 6175–6194 (2015).
9. Lind K, Kubista M. Development and evaluation of three real-time immuno-PCR assemblages for quantification of PSA. J. Immunol. Methods 304(1–2), 107–116 (2005).
10. Attallah C, et al. Design and validation of an immuno-PCR assay for IFN-α2b quantification in human plasma. Bioanalysis 11(23), 2175–2188 (2019).
11. Woodbury N, et al. Application of multiplexed pharmacokinetic immunoassay to quantify in vivo drug forms and coadministered biologics. Bioanalysis 11(24), 2251–2268 (2019).
12. Stevenson LF, Purushothama S. Parallelism: considerations for the development, validation and implementation of PK and biomarker ligand-binding assays. Bioanalysis 6(2), 185–198 (2014).
13. Lee JW, et al. Fit-for-purpose method development and validation for successful biomarker measurement. Pharm. Res. 23(2), 312–328 (2006).
14. Stevenson L, et al. Large molecule specific assay operation: recommendation for best practices and harmonization from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. AAPS J. 16(1), 83–88 (2014).
15. Desilva B, et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm. Res. 20(11), 1885–1900 (2003).
16. Lee JW, et al. Bioanalytical approaches to quantify ‘total’ and ‘free’ therapeutic antibodies and their targets: technical challenges and PK/PD applications over the course of drug development. AAPS J. 13(1), 99–110 (2011).
17. Pearson JT, Rock DA. Bioanalytical approaches to assess the proteolytic stability of therapeutic fusion proteins. Bioanalysis 7(23), 3035–3051 (2015).
18. Vasicek LA, et al. Direct quantitation of therapeutic antibodies for pharmacokinetic studies using immuno-purification and intact mass analysis. Bioanalysis 11(3), 203–213 (2019).
关于威廉希尔williamhill医药 临床研究效劳：
威廉希尔williamhill医药拥有一支规模庞大、专业成熟的临床研究步队 ，可提供包括医学、项目治理、监查、稽察、数据治理和统计剖析、生物样本检测在内的临床试验全流程解决计划 。截至2020年 ，威廉希尔williamhill医药效劳的客户超1000家 ，完成800多项临床试验项目 ，助力客户获得新药证书60多项、生产批件凌驾80项 。拥有富厚的临床试验效劳经验 ，效劳项目涵盖临床研究各个领域 ，在肿瘤、肝病、消化等立异药领域拥有奇特的临床效劳体系 。
威廉希尔williamhill医药在全国设有40多个临床监查网点 ，与全国近600个临床试验机构展开相助 ，并运用ORACLE OC/RDC及CTMS系统 ，控制临床数据收罗的实时性、治理临床试验历程的规范性 。
